增強靶向cccDNA的CRISPR/Cas9的抗病毒療效

編者按：第73屆美國肝病研究學會年會（AASLD 2022）于當地時間2022年11月4日 - 8日在美國召開。會議期間披露了多項乙肝新藥研究進展，肝霖君精選其中的重要進展與大家分享。

現有的抗HBV藥物主要包括核苷和干擾素α，兩者經有效聯合可幫助慢乙肝患者實現臨床治愈，但由于核苷和干擾素α均不直接靶向cccDNA，cccDNA無法完全清除，慢乙肝患者的完全治愈至今尚未實現。基因編輯療法CRISPR/Cas9可直接靶向cccDNA而發揮抗病毒作用，具有完全消除HBV的潛力，但目前仍處于臨床前研究階段。

在AASLD 2022摘要中發表的一項研究結果表明，通過抑制非同源末端連接（NHEJ）介導的DNA修復機制可以增強靶向cccDNA的CRISPR/Cas9的抗病毒效果。

研究方法

研究人員設計了靶向HBV基因組的gRNA（HBV-gRNA）和非靶向HBV或人類基因組的對照gRNA（Cont-gRNA），將串聯Cas9和HBV-gRNA（或Cont-gRNA）的慢病毒表達載體（HBV-gRNA/Cas9或Cont-gRNA/Cas9）轉入感染HBV 19天的原代人肝細胞（PHHs）中。誘導表達Cas9的HBV易感細胞（HepG2-hNTCP-iCas9）用單個HBV-gRNA或Cont-gRNA慢病毒載體進行轉染。HBV感染4天后，用多西環素（DOX）誘導Cas9表達。進一步用HBV治療或DNA合成/修復途徑相關藥物處理這些細胞，并檢測其在CRISPR/cas9介導的抗HBV治療中的作用。

研究結果

HBV-gRNA轉染降低了HepG2-hNTCP-iCas9細胞上清中HBV DNA和HBsAg水平，以及細胞內pgRNA和cccDNA水平；同樣，HBV-gRNA/Cas9轉染降低了PHHs上清中HBV DNA和HBsAg水平以及細胞內pgRNA和cccDNA水平。CRISPR/Cas9治療不激活先天免疫系統。

恩替卡韋、干擾素α、Bay41-4109（衣殼組裝調節劑）不改變CRISPR/Cas9對HepG2-hNTCP-iCas9細胞的治療效果。作用于DNA合成/修復機制的藥物中，CD437（DNA合成抑制劑）也不改變CRISPR/Cas9對HepG2-hNTCP-iCas9細胞的治療效果，而奧拉帕尼（PARP抑制劑）顯著增強了CRISPR/Cas9治療的抗病毒療效。抑制BRCA（對同源重組至關重要）不改變CRISPR/Cas9的治療效果，但抑制PARP2或HPF1（參與DNA雙鏈斷裂修復的初始步驟），以及LIG4（對NHEJ至關重要，NHEJ是一種特殊的DNA雙鏈斷裂修復機制）顯著增強了CRISPR/Cas9的抗病毒療效。

研究結論

奧拉帕尼抑制NHEJ介導的DNA修復機制增強了靶向HBV基因組的CRISPR/Cas9的治療效果。

肝霖君有話說

基因編輯CRISPR/Cas9技術提供了完全治愈慢乙肝的可能，但由于基因編輯效率、脫靶等方面原因，單靠CRISPR/Cas9完全消除HBV是比較困難的。本文研究顯示經抑制NHEJ介導的DNA修復增強了CRISPR/Cas9的功效，這種新型組合療法可能有助于基因編輯技術完全消除HBV的早日實現。

參考文獻：

Murai K, Kodama T, Hikita H, et al. Olaparib enhances the anti-viral effect of CRISPR/Cas9 therapy targeting HBV genome via NHEJ-mediated DNA repair machinery. AASLD2022. Abstracts (1166).

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